STRESE BAĞLI MİDE MUKOZASI HASARINDA ENDOJEN GLUTATYON TÜKENİŞİNİN ENERJİ METABOLİZMASI İLE İLİŞKİSİ*


Emel ZENGİN ULAKOĞLU, M. Koray GÜMÜŞTAŞ,
Ahmet BELCE, Tuncay ALTUĞ, Emine KÖKOĞLU


Background.- Reactive oxygen species may play an important role in gastric ulceration induced by several kinds of stress. Detoxification of these radical species involves conversion of reduced glutathione to oxidized glutathione. Endogenous glutathione has been reported as a possible mediator in gastric mucosal protection. Stress-induced ischemia may adversely affect gastric energy metabolism, an important factor in mucosal self-defense against injury. The objective of this study was to examine the relationship between endogenous glutathione and ATP levels in stress-induced gastric mucosal ulceration.

Design.- On 20 male Wistar type albino rats, who where subjected to stress by the immobilization, ATP levels was determined by the modified Bucher technique, reduced glutathione levels by the method of Fairbanks and glutathione peroxidase activities by the spectrophotometric assay of Paglia and Valentine.

Results.- Significant decreases were found in ATP, reduced glutathione levels and glutathione peroxidase activities in the rats subjected to stress.

Conclusion.- Regeneration and de novo synthesis of reduced glutathione might be reduced as a consequence of decreased of availability of ATP and some cofactors induced by the ischemic episode.

Zengin UIakoğlu E, Gümüştaş MK, Belce A, Altuğ T, Kökoğlu E. The relationship between endogenous glutathione depletion and energy metabolism in stress-induced gastric mucosal injury. Cerrahpaşa J Med 1998; 29 (3): 127-131.

GİRİŞ Başa dön

Glutatyon (y-glutamilsistein glisin), organizmada tiyol grubu içeren, düşük molekül ağırlıklı önemli bir tripeptiddir.1,2 DNA ve protein sentezleri, enzim aktivitelerinin düzenlenmesi, hücre içi ve dışı transportlar gibi hücresel fonksiyonları dışında başlıca antioksidan olarak hücre savunmasında da önemli rolü vardır.1,3,4

İndirgenmiş glutatyon (GSH) içerdiği tiyol grubu aracılığı ile hücre içinde redoks potansiyeli yüksek bir ortam sağlayarak, hücreyi oksidatif hasarlara karşı korur. Glutatyon peroksidaz (GPx) isimli enzimin kofaktörlüğünü yaparak, hidrojen peroksidi metabolize eder.1,2,4,5

Son yıllarda yapılan çalışmalarda, çeşitli stres modellerinin reaktif oksijen ürünlerinin (ROS) oluşumunu hızlandırdığı ve lipid peroksidasyonlarına yol açtığı gösterilmiştir.6,7 ROS'un oluşturduğu oksidatif hasar oksidan stres olarak tanımlanmaktadır. Oksidan stres ile GSH düzeylerinin azaldığı bilinmektedir. İn vivo8 ve invitro9 yapılan deneylerde, endojen GSH'ın çeşitli hasarlarda mide mukozası bütünlüğünün korunmasında önemli bir mediatör olabileceği görüşü ileri sürülmektedir. Diğer yandan stres ülserine bağlı iskeminin, hasara karşı savunmada önemli bir faktör olan mukozal enerji metabolizmasını azalttığı da gösterilmiştir.10,11 Ancak literatür araştırmamızda, stres ülserine bağlı hem glutatyon hem de ATP düzeylerinin azalması ile ilgili mekanizmalann yeterli olarak izah edilmediğini görmekteyiz.

Bu çalışmadaki amacımız, hareketsizlik yöntemiyle stres ülseri geliştirdiğimiz sıçan mide mukozalarında, glutatyon düzeylerine ATP değişimlerinin ne şekilde etki ettiği, ayrıca serbest radikallerin detoksifikasyonu esnasında indirgenmiş glutatyonun (GSH) oksitlenmiş glutatyona (GSSG) dönüşümünü katalizleyen GPx aktivitelerinin incelenmesidir.

YÖNTEM VE GEREÇLER Başa dön

Deneyler, İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Üretim ve Araştırma Laboratuvarından sağlanan 200-250 gr ağırlığında 20 adet erkek Wistar Albino sıçan ile yapıldı. Tüm deney hayvanları oda temperatüründe 24 saat aç bırakıldıktan sonra, 10 tanesine 6 saat hareketsizlik yöntemiyle stres uygulandı. Bu sürenin sonunda, genel eter anestezisi altında servikal dislokasyon ile sakrifiye edilen sıçanların laparatomi yoluyla mideleri çıkartıldı. Elde edilen mideler, buzlu zemin üzerinde büyük kurvaturları boyunca açıldı. Mide içeriği soğutulmuş serum fizyolojik ile yıkandı ve mide buzlu zemin üzerine gerildi.

Ülser indeksi tayini: Mide mukozasında meydana gelen hasar skalada verilen kriterlere göre değerlendirildi: 0= hiç hasar yok; 1= küçük; 1/2 mm ülser; 2= orta, 3-4 mm ülser; 4=geniş, 5-6 mm ülser. Her bir grubun total skor derecesinin deney hayvanı sayısına bölünmesiyle ortalama ülser indeksi saptandı (Şekil 1).

Doku çalışmaları: Mide mukozaları buz üzerinde bistüri yardımıyla kazındı ve elde edilen örnekler derhal -70oC'da donduruldu.

ATP düzeyi tayini: Doku tartıldıktan sonra, buz içinde teflon uçlu homojenizatör yardımıyla PGA (3-fosfogliserik asid) tampon çözeltisi ile % 20'lik (w/v) homojenatı hazırlandı. Hazırlanan homojenat üzerine TCA (triklorasetik asid) çözeltisi % 12 (v/v) ilave edilerek proteinler çöktürüldü. Bu karışım 4oC'da ve 3000 rpm devirde 10 dak. santrifüj edilerek süpernatant elde edildi. Süpernatant içinde ATP düzeyi, Bucher'in Adams12 tarafından modifiye edilen yöntemine dayanan Sigma diagnostik kitine uygun olarak çalışıldı (Sigma Kat No. 366).

GSH düzeyi ve GPx aktivitesi tayinleri: Doku tartıldıktan sonra, teflon uçlu homojenizatör ile soğuk 20 mM Tris-HCI tampon içinde (pH 7.4) % 33 (w/v) olacak şekilde homojenize edildi. Homojenat buz içinde 30 saniyelik aralıklarla 3 kez sonikasyona tabi tutuldu (MSE sonikator, güç çıkışı 38 watt) ve daha sonra 4oC'da ve 5000 rpm devirde 20 dak. santrifüj edildi. Elde edilen süpernatantta GSH düzeyi DTNB [5,5'-Ditiyobis (2- nitrobenzoik asid)] ile renklendirme temeline dayanan yöntem13 ile, GPx aktivitesi ise Paglia ve Valentine'nin kinetik spektrofotometrik esasa dayanan Randox kit yöntemiyle14 tayin edildi.

Süpernatantta protein miktarları Lowry'nin spektrofotometrik yöntemine uygun olarak ölçüldü.15

BULGULAR Başa dön

Uygulanan stres modeli ile elde edilen sonuçlar Tablo I'de verilmektedir. Kontrol grubu ve stres grubu sıçanların mide mukozası ATP ve GSH düzeyleri,GPx aktiviteleri Şekil 2, 3 ve 4'te gösterilmektedir.







TARTIŞMA Başa dön

GSH, tüm memeli hücrelerinde bol miktarda (0.5-10 mM) sentezlenir. Bu sentez 2 basamakta gerçekleşir. Birinci basamakta, y-glutamilsistein sentetaz isimli enzim GSH'ın prekürsör amino asidleri olan glutamat ve sisteinden, y-glutamilsisteinin oluşumunu katalizler. İkinci basamakta ise, glutatyon sentetaz, glisin ve y-glutamil-sisteinden glutatyonu oluşturur. GSH negatif feed-back ile glutamilsistein oluşum hızını ve böylelikle kendi sentezini de denetler. Bu sentezde bir molekül GSH için 2 molekül ATP'nın hidrolizi gerekir.9,16 (Şekil 5) GSH sürekli olarak hücreler tarafından kullanıldığından, sentezinin inhibisyonu hızlı tükenmesine yol açabilir.1,3,4

Oksidan stres sonucunda artan ROS oluşumunun hücre hasarlarındaki etkileri bilinmektedir. Bu ürünlerin detoksifikasyonu, glutatyonun indirgenmiş formunun (GSH) oksitlenmiş dimer formuna (GSSG) dönüşümü ile sağlanmaktadır. Glutatyon peroksidazın (GPx) katalizlediği bu reaksiyonda, GSH'ın enzim aktivitesi için esas olduğu açıktır. Okdidasyon sonucunda oluşan GSSF (Glutatyon disülfid) ise glutatyon radüktaz isimli enzim aracılığıyla ile geri dönen bir siklusla GSH'a rejenere olmaktadır.5,9

Hücre yüksek miktarda oksidana maruz kaldığında, GSSG oluşumu metabolik sınırını aşmakta ve oksidatif stres oluşmaktadır. Detoksifiye olamayan oksidanlar membran lipidlerinin ve hücrenin çeşitli fonksiyonel ve yapısal proteinlerinin bozulmasına neden olmaktadır.5,16 Ayrıca GSSG'nin kendisi de, proteinlerin sülfhidril gruplanyla (-SH) reaksiyonlaşarak kalıcı zararlı etkiler meydana getirmektedir.5,17 Bu son olaya bağlı hücre içi GSSG birikiminin, ATP'ye bağımlı bir taşıyıcı mekanizmanın varlığı ile bertaraf edildiği bildirilmiştir.18 Diğer taraftan gastrik mukozada glikojen depolarının az olduğu ve devamlı glikoz ihtiyacının karşılanması gerektiği bilinmektedir.19

Stresin yol açtığı iskemi sonucunda oluşan H2O2 ve serbest radikaller, glikoliz ve oksidatif fosforilasyonu inhibe ederek ATP miktarının düşmesine yol açarlar.16 Tümör hücrelerinde yapılan deneylerde, glikolitik yolun GAPDH (gliseraldehid-3P04 dehidrogenaz) seviyesinde inhibe olduğu gösterilmiştir.16 Çalışmamızda stres grubu sıçanların mide mukozası ATP miktarlarında elde ettiğimiz düşük sonuçlar (p<.001) literatür bilgileriyle10,11 uyumluluk göstermektedir.

Literatür araştırmamızda sterese bağlı glutatyon miktarının tükenmesiyle ilgili mekanizmaların ise yeterli izah edilmediğini görmekteyiz. Stresin neden olduğu mukozal GSH düzeylerinde elde ettiğimiz azalmaları şu faktörlere bağlayabiliriz. GSH; artan ROS oluşumun önlemede GPx'a substrat teşkil ettiğinden hızla tükenmektedir.1,3,4 Diğer taraftan iskemi sonucunda mukozada ATP konsantrasyonundaki düşmeler, bir yandan GSH sentezinin yavaşlamasına yol açarken, diğer yandan GSSG'nin salgılanmasındaki azalmaya da neden olmaktadır. Böylece hücre içinde GSSG birikiminin bir kez daha artarak, ROS'un oluşturduğu hasarlara ilaveten GSSG'ye bağlı etkilerin de kamçılandığını düşünmekteyiz. Gerçekten de stres erozyonları ile ilgili bulgularımız bu izaha uymaktadır. Stres grubunun ülser indeksinde saptadığımız artmalar (p<.001 ) ATP ve GSH düzeylerindeki azalmalarla uyumluluk göstermektedir (Tablo I ve Şekil 2, 3).

İskemik dokunun enerji metabolizmasiyla ilgili değişiklikleri arasinda; hücrede NADPH oluşumunun inhibisyonu da yer almaktadır.5 Glutatyon redüktaza kofaktörlük teşkil eden NADPH miktarı azalmasının, mide mukoza hücrelerinde GSH düzeylerinin düşmesinin bir başka nedenini oluşturabileceğini düşünmekteyiz.

Stresin oksidatif doku hasarındaki etkileri incelendiğinde, ROS'un peroksidaz aktivitesini oksidatif olarak inaktive ettiği bildirilmektedir.20 Stres sonucunda mide mukoza hücrelerinde artan ROS'a karşı GPx aktivitelerinde saptadığımız azalmalar (Tablo I ve Şekil 4), hücre hasarının diğer nedenleri arasında olabilir.

ÖZET Başa dön

Son yıllarda yapılan çalışmalarda, stresin yol açtığı doku hasarında reaktif oksijen ürünlerinin (ROS) rolü üzerinde durulmakta, indirgenmiş glutatyonun (GSH) ise antioksidan savunmada önemli bir mediatör olduğu ileri sürülmektedir. Bu çalışmada hareketsizlik yöntemiyle strese maruz bırakılan sıçan mide mukozalarında GSH düzeylerinin ATP değişimleriyle ne şekilde etkilendiği araştırılmıştır. Ayrıca etkili diğer faktörler de incelenmiştir.

Stres grubu sıçanlarda mide mukozası GSH ve ATP düzeylerinde kontrol grubuna oranla istatistiksel olarak anlamlı azalmalar kaydedildi (p<.001). Bu anlamlı azalmalar glutatyon peroksidaz (GPx) aktivitelerinde de saptandı (p<.001).

Strese bağlı iskemi sonucunda oluşan ROS, glikoliz ve oksidatif fosforilasyonu inhibe eder. ROS oluşumunun enerji metabolizmasındaki negatif etkileri, bir yandan GSH sentezinin ve rejenerasyonunun azalmasına neden olurken, diğer yandan okside glutatyonun salgılanma kusuruna da yol açmaktadır. Ayrıca, ROS, H2O2'in detoksifikasyonunda rol oynayan GPx'in da oksidatil inaktivasyonuna neden olmaktadır. Tüm bu değişiklikler dokuda lezyon oluşumunu kamçılamaktadır.

KAYNAKLAR Başa dön

  1. Meister A, Anderson ME. Glutathione. Ann Rev Biochem 1983; 52: 711-760.
  2. Meister A. Glutathione, ascorbate and cellular protection. Cancer Res Suppl 1994; 954: 1969s-1975s.
  3. Deneke SM, Fanburg BL. Regulation of cellular glutathione. Am J Physiol 1989; 257: L163-L173.
  4. Meister A. Selective modification of glutathione metabolism. Science 1983; 220: 472-477.
  5. Ambrosio G, Santoro G, Tritto I et al. Effects of ischemia and reperfusion on cardiac tolerance to oxidative stress. Am J Physiol 1992; 262: H23-H30.
  6. Das D, Banerjee RK. Effect of stress on the antioxidant enzymes and gastric ulceration. Mol Cell Biochem 1993; 125: 115-125.
  7. Goldin E, Ardite E, Elizalde JI et al. Gastric mucosal damage in experimental diabetes in rats: role of endogenous glutathione. Gastroenterology 1997; 112: 855-863.
  8. Loguercio C, Taranto D, Beneduce F et al. Glutathione prevents ethanol induced gastrc mucosal damage end depletion of sulfhydryl compounds in humans. Gut 1993; 34: 161-165.
  9. Mutoh H, Hiraishi H, Ota S et al. Protective role of intracellular glutathione against ethanol-induced damage in cultured rat gastric mucosal cells. Gastroenterology 1990; 98: 1452-1459.
  10. Menguy R. Role of gastric mucosal energy metabolism in the etiology of stress ulceration. World J Surg 1981; 5: 175-180.
  11. Mozsik GY, Kraly A, Suto G et al. ATP breakdown and resynthesis in the development of gastrointestinal mucosal damage and its prevention in animals and human. Acta Physiol Hung 1992; 80: 39-80.
  12. Adams H. Adenosine 5'-triphosphate determination with phosphoglycerate kinase. In Methods of Enzymatic Analysis. Ed. Bergmeyer HU. New York, Academic Press, 1963; 539-543.
  13. Fairbanks V, Klee GG. Biochemiacal aspects of hematology. In: Textbook of Clinical Chemistry. Ed: Tietz NW, Philadelphia, Saunders Company,1986; 1508-1510.
  14. Paglia DE, Valetine WN. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erytrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med 1967; 70: 158-169.
  15. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL et al: Protein measurement with Folin phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193: 265-275.
  16. Cochrane CG. Cellular injury by oxidants. Am J Med 1991; 3C23S-3C30S.
  17. Scherer NM, Deamer DW. Oxidative stress impairs the function of the sarcoplasmic reticulum by oxidation of sulphyrdryl groups in the Ca++-ATPase. Arch Biochem Biophys 1986; 246: 589-601.
  18. Ishikawa T, Zimmer M, Sies H. Energy-linked cardiac transport system for glutathione disulfide. FEBS Lett 1986; 200: 128-132.
  19. Menguy R, Desbaillets L, Masters YF. Mechanism of stress ulcer: influence of hypovolemic shock on energy metabolim in the gastric mucosa. Gastroenterology 1974; 66: 46-55.
  20. Das D, De PK, Banerjee RK. Thiocyanate a plausible physiological electron donor of gastric peroxidase. Biochem J 1995; 305: 59-64.
  • Anahtar Kelimeler: Stres ülseri, Glutatyon, Adenozin trifosfat, Glutatyon peroksidaz; Key Words: Stress ulcer, Glutathione, Adenosine triphosphate, Gluthathione peroxidase; Alındığı Tarih: 06 Mayıs 1998; Doç. Dr. Emel Zengin Ulakoğlu, Doç. Dr. M. Koray Gümüştaş, Doç. Dr. Ahmet Belce, Prof. Dr. Emine Kökoğlu: İÜ Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Biokimya Anabilim Dalı; Doç. Dr. Tuncay Altuğ: İÜ Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Deney Hayvanları Bölümü. Yazışma Adresi (Address): Dr. E. Zengin Ulakoğlu, İÜ Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Biokimya Anabilim Dalı, 34303, Cerrahpaşa, İstanbul.